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到了三級文明，有關克隆，已經研究到了分子水平，也就是分子克隆！

什麽是分子克隆呢？

在分子水平上提供一種純化和擴增特定dna片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法将它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉化與轉導的方式，引入适合的寄主體内得到複制與擴增，然後再從篩選的寄主細胞内分離提純所需的克隆載體，可以得到插入dna的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。

分子克隆是指分離一個已知dna序列，并以invivo**内方式獲得許多複制品的過程。這一複制過程經常被用于增加并獲取dna片段中的基因，但也可用來增加某些任意的dna序列，如啓動子、非編碼序列、化學合成的寡核苷酸或是随機的dna片斷。

将dna片段或基因與載體dna分子共價連接，然後引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分爲dna和cdna克隆兩類。

cdna克隆是以ma爲原材料，經體外反轉錄合成互補的dnacdna，再與載體dna分子連接引入寄主細胞。每一cdna反映一種ma的結構，cdna克隆的分布也反映了ma的分布。特點是：

有些生物，如a病毒沒有dna，隻能用cdna克隆;

cdna克隆易篩選，因爲cdna庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cdna克隆隻含一個ma的信息;

cdna能在細菌中表達。cdna僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，隻有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。

那麽，如何做到這一點呢？

首先是dna片段的制備！

常用以下方法獲得dna片段：1用限制性核酸内切酶将高分子量dna切成一定大小的dna片段;2用物理方法如超聲波取得dna随機片段;3在已知蛋白質的氨基酸順序情況下。用人工方法合成對應的基因片段;4從ma反轉錄産生cdna。

其次是載體dna的選擇，這裏要知道，什麽是質粒。

質粒是細菌染色體外遺傳因子。dna呈環狀，大小爲1-200千堿基對kb。在細胞中以遊離超螺旋狀存在。很容易制備。質粒dna可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀态，一是‘緊密型‘;二是‘松弛型‘。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇标記的特點。質粒型載體一般隻能攜帶10kb以下的dna片段，适用于構建原核生物基因文庫，cdna庫和次級克隆。

柯斯cos質粒是一類帶有噬菌體dna粘性末端順序的質粒dna分子。是噬菌體-質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源dna片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段dna，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。

而噬菌體dna。常用的λ噬菌體的dna是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體dna兩端。中間是非必需區，進行改造後組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最适用于構建真核生物基因文庫和cdna庫。

m13噬菌體是一種獨特的載體系統，它隻能侵襲具有f基因的大腸杆菌，但不裂解寄主菌。m13dnarf在寄主菌内是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主複制，制備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈dna的m13噬菌體。又能方便地制備單鏈dna，用于dna順序分析、定點突變和核酸雜交。

接着是dna載體的連接。

dna分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：1粘性末端連接。dna片段兩端的互補堿基順序稱之爲粘性末端，用同一種限制性内切酶消化dna可産生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢複原樣，有些限制性内切酶雖然識别不同順序，卻能産生相同末端。2平頭末端連接，用物理方法制備的dna往往是平頭末端，有些酶也可産生平頭末端。平頭dna片段可在某些dna連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高;3同聚寡核苷酸末端連接。4人工接頭分子連接，在平頭dna片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶識别位點的寡核苷酸片段，經限制性内切酶作用後就會産生粘性末端。

連接反應需注意載體dna與dna片段的比率。以λ或cos質粒爲載體時。形成線性多連體dna分子，載體與dna片段的比率高些爲佳。以質粒爲載體時。形成環狀分子，比率常爲1∶1。

最後是引入寄主細胞。

常用兩種方法：1轉化或轉染。方法是将重組質粒dna或噬菌體dnam13與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置于冰上，待dna被吸收後鋪在平闆培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組dna低，原因是連接效率不高，有許多dna分子無轉化能力，而且重組後的dna分子比原載體dna分子大，轉化困難。2轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱爲轉導，一般轉導的效率比轉化高。

此時的李安，操控着墨蓮人，不斷的收集材料，進行着研究。

三級文明，分子克隆有很多的作用！

分子克隆技術是發展起來的不久，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域。打開了人類了解、識别、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對于工業、農牧業和醫學産生深遠影響，并将爲解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。

利用分子克隆技術已将胰島素。人、牛和雞的生長激素、人的幹擾素、松弛素、促紅細胞生長激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用發酵工業進行了大規模生産。還可提高微生物本身所産生的蛋白酶類和抗生素類藥物的産量。

通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉爲正常細胞的可能性。例如sv40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉爲正常細胞。爲治療半乳糖血症，用帶有大腸杆菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血症患者的離體培養細胞，發現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，并确實能代謝半乳糖。

通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉爲正常細胞的可能性，例如sv40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉爲正常細胞。爲治療半乳糖血症，用帶有大腸杆菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血症患者的離體培養細胞。發現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，并确實能代謝半乳糖。

植物遺傳工程對提高農作物的産量、培育新的農作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。

一個有關于李安的軀體正在不斷的形成。。

“這是一個多順反子，在這裏，在這裏！爲了自己的身體變得完美！”

既然是建造自己的身體，李安盡量讓自己變得完美。

在原核細胞中，通常是幾種不同的ma連在一起，相互之間由一段短的不編碼蛋白質的間隔序列所隔開，這種ma叫做多順反子ma。順反子的概念來自遺傳學中的順反重組試驗，是确定交換片段究竟在一個基因内還是屬于兩個基因的試驗，簡言之。一個順反子就是一個基因，多順反子就是多個基因。真核生物中也有多順反子，比如c。elegans共有13500個基因。約25%的是多順反子。

ma存在于原核和真核生物的細胞質及真核細胞的某些細胞器如線粒體和葉綠體中。a病毒和a噬菌體中的a既是遺傳信息的載體又具有ma的功能。生物體ma種類的多少與生物進化水平有關，高等生物所含的遺傳信息多，ma的種類也多。生物體内某種ma的含量根據需要而有不同，如5齡蠶後部絲腺體的主要任務是快速合成大量絲心蛋白，因而編碼絲心蛋白的ma含量特别多。有些細菌需要不斷多順反子适應外部環境，其體内編碼某些誘導酶的ma的含量也較多。

原核和真核生物ma有不同的特點：1原核生物ma常以多順反子見的形式存在，即一條ma鏈編碼幾種功能相關聯的蛋白質。真核生物ma一般以單順反子的形式存在，即一種ma隻編碼一種蛋白質。2原核生物ma的轉錄與翻譯一般是偶聯的，即轉錄尚未完畢。蛋白質的轉譯合成就已開始。真核生物轉錄的ma前體則需經後加工，加工爲成熟的ma與蛋白質結合生成信息體後才開始。工作信息體中蛋白質與a之比約爲3。3原核生物ma半壽期很短，一般爲幾分鍾。最長隻有數小時a噬菌體中的a除外。真核生物ma的半壽期較長，如胚胎中的ma可達數日。4原核與真核生物ma的結構特點也不同。

一級結構與功能的關系：原核生物ma一般5端有一段不翻譯區，稱前導順序，3端有一段不翻譯區，中間是蛋白質的編碼區，一般編碼幾種蛋白質。如大腸杆菌乳糖操縱子ma編碼3條多肽鏈;色氨酸操縱子ma編碼5條多肽鏈。也有單順反子形式的細菌ma，如大腸杆菌脂蛋白ma。原核生物ma分子中一般沒有修飾核苷酸，也沒有5端帽子結構和3端聚腺苷酸尾巴。在原核生物ma的起始密碼子aug附近5方向上遊的一小段長短不等的順序，含有較多的嘌呤核苷酸，被稱爲sd順序。未完待續

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