俗話說，堡壘最容易從内部被攻破。這句話應用在鐮倉幕府的衰亡上是再合适不過。1333年，鐮倉幕府的禦家人足利尊氏在各地反幕府的動亂中迅速崛起，很快成爲讨幕中堅，最終與各地豪強一起迫使北條氏一族全部自殺，鐮倉幕府就此完結。當然，這時候意得志滿的足利尊氏不會想到，近250年以後，自己的子孫也會被武将逼死，成爲曆史的煙雲。
1331年6月，在足利尊氏與地方豪族推翻鐮倉幕府的統治後，因多次謀劃倒幕行動而被北條氏流放到隐歧島的後醍醐天皇返回京都，廢除了由鐮倉幕府扶持的光嚴天皇，再次登基，重新掌控了朝政。1334年，後醍醐天皇改年号爲“建武”，并實施了一系列的新政，史稱“建武中興”。
後醍醐天皇實施的新政，最重要的部分就是撤銷威脅天皇權力的關白、攝政等職務，一切大權由天皇本人總攬，對皇室和大貴族的利益極力保護，卻對在推翻鐮倉幕府中立下戰功的武士的利益不聞不問，這種做法引起了各地武士的極度不滿。而與此同時，恢複天皇之位沒多久的後醍醐天皇爲了滿足一己私欲，無視長年戰亂給百姓帶來的苦難，肆意增加稅收，征發勞役，在京都大興土木，出現了“兵革之後，世局未穩，國費民苦”的亂象。後醍醐天皇的倒行逆施激起了農民的不滿，由此，後醍醐天皇逐漸失去了武士和農民對他的支持。
此時的足利尊氏雖然獲得了天皇的賜名，但是并沒有獲得他夢寐以求的“征夷大将軍”的名号，反倒受到後醍醐天皇的種種限制，這讓足利尊氏非常失望。
1335年7月，即建武二年，北條氏旁支北條時行在信濃舉兵，并很快攻陷鐮倉，史稱“中先代之亂”。8月初，足利尊氏未等天皇下诏，率領500名騎兵，離開京都，與其弟足利直義會合，大破北條時行，奪回了鐮倉。占據鐮倉後，足利尊氏并沒有返回京都，而是自稱征夷大将軍，向後醍醐天皇豎起了反旗，這讓後醍醐天皇十分惱火。11月19日，天皇任命尊良親王、新田義貞爲正副征讨将軍，讨伐足利尊氏。足利尊氏與其弟率軍大敗天皇的軍隊，其間，天皇方面也曾多次擊敗足利尊氏。1336年5月，足利尊氏進入京都，擁立光嚴天皇的同母胞弟豐仁親王即位，是爲光明天皇。“建武中興”由此宣告結束。
以勝利者姿态進入京都的足利尊氏很快軟禁了後醍醐天皇，同年11月，後醍醐天皇被迫将象征天皇權威的三神器交給光明天皇，自己則被尊爲上皇。但是後醍醐天皇并不甘心被人擺布，12月21日晚，他裝扮成女性貴族，乘車逃離京都，在吉野建立了新的政權，并宣布交給光明天皇的三神器爲僞造品。自此形成了與京都皇室對立的局面，日本曆史上的南北朝由此形成。
北朝的實際控制者足利尊氏在被光明天皇正式任命爲“征夷大将軍”後重啓武家政治，在京都建立了足利幕府。幕府建立不久，爲了整頓武家制度，改革朝政，足利尊氏頒布了武家法典《建武式目》。《建武式目》提出“居安思危”的觀點，認爲首要之責是“早休萬人愁”，“政在安民”。在這一思想的指導下，《建武式目》提出要禁止奢侈，力行節儉，不得受賄行賄；選用賢能之人擔任地方官，并要求豪強不得兼并私宅，以減少破産流浪者；委任效忠足利氏的有功、有才幹的将領爲各地守護。
1339年8月16日，53歲的後醍醐天皇因病去世。相傳他臨死前，一手握着《法華經》，一手撫劍，還立下遺诏：“縱領玉骨已埋南山，魂魄亦當常望北阙。”因此，後醍醐天皇的陵墓也與一般的朝南座北的傳統葬式不一樣，而是朝北坐南埋葬。後醍醐天皇死後沒多久，追随他的幾個南朝著名武将也相繼戰死，南朝似乎“氣數已盡”，但是由于足利尊氏與其弟足利直義的内杠，南朝又殘喘了50多年。
足利尊氏在起兵讨伐鐮倉幕府之初，足利直義就一直輔佐足利尊氏，足利尊氏也視足利直義爲左膀右臂，對他極爲器重。足利幕府建立後，足利尊氏的家臣高師直擔任重要職位，深得尊氏信任，備受恩寵，然後職權越高，驕奢越重，手下部将很是不滿，足利直義對此也深爲憤恨，決心除掉高師直。
1349年，足利直義與高師直的鬥争發展到了白熱化階段，高師直要求足利尊氏革除足利直義的一切職務。足利尊氏答應了高師直的要求，撤掉了其弟全部職務。此後，高師直更爲驕恣，而足利尊氏與足利直義之間的關系也因此日趨緊張。
1350年，足利尊氏與足利直義兵戎相見，足利直義投奔南朝，并于次年大敗足利尊氏統領的北朝軍隊。尊氏派人求和，足利直義殺死高師直，随後足利尊氏與足利直義攜手言和。第二年，足利尊氏與其子一同歸順了南朝。但是兄弟倆的和睦局面并沒有維系多久，不久，足利尊氏又與足利直義産生了沖突，1352年2月，足利尊氏毒死了自己的弟弟。足利直義雖死，但他養子足利直冬率領着斯波高經、桃井直常、石堂義房、山名時氏等舊足利直義派依然與足利尊氏作戰，先後數次占領過京都。
1358年4月30日，足利尊氏病故，時年54歲，埋在京都的衣笠山下的等侍寺内。足利尊氏死後，其子足利義诠繼任将軍，在執事斯波義将的輔佐下，足利義诠穩固了幕府統治，并逐步壓制住了南朝勢力。
1368年，年僅10歲的足利義滿繼任第三代幕府将軍，由管領細川賴之任輔佐。足利義滿成年親政後，顯示出卓越的統治與領導能力，先後平定了土岐賴康、山名氏清等地方守護的叛亂，幕府統治得以進一步鞏固。同時，經過幾次大的征伐，南朝的勢力徹底衰退。1392年，足利義滿對南朝提出統一的呼籲，并順利實現南北朝合體，成功地結束長達60年的分割狀态。由此，足利義滿在全國範圍确立起幕府将軍的絕對統治權，成爲室町幕府最盛期的締造者。